刘嘉铭，刘巾男，魏明天，胡鑫，应斌武

白色念珠菌是生物材料相关性感染的主要病原体之一[1]。近十多年来，白色念珠菌的感染率和病死率均逐年快速增长，并占到医源性感染的约50%。研究发现白色念珠菌感染中多有生物膜的形成。生物膜(biofilm)是指一种附着于无活力的或活组织表面的、由其自身产生的细胞外基质(extracellularmaxtrix，ECM)包裹的有结构的菌细胞群体[2]。生物膜状态下的黏附不但形成持续的感染源，而且可作为天然屏障帮助白色念珠菌抵御抗真菌药，其在白色念珠菌侵袭致病、播散传染及耐药发生方面具有重要意义[3]。

1白色念珠菌生物膜的形成及结构

在扫描电镜下，白色念珠菌生物膜形成过程首先是酵母细胞吸附，经过3h~6h形成芽管，完全成熟的白色念珠菌的生物膜需24h~48h的孵育[4]。成熟的生物膜在荧光显微镜下表现为酵母态细胞黏附在生物材料的表面，在这之上是被ECM包裹的菌丝态细胞[3]。白色念珠菌的不同菌株形成生物膜的能力也不同，相同的菌株在不同条件下形成的白色念珠菌生物膜模型之间存在一些差异[5]。基质和生长环境不同，如附着层表面材料的不同[6]，生物膜的结构也各不相同[7]。其机制可能是成熟白色念珠菌生物膜的结构受pH、还原梯度、供氧情况等因素的影响[7]。在相同的导管材质上，体内与体外生物膜模型存在着一定的差异，体内生物膜的ECM明显厚于体外生物膜的ECM，且体内生物膜完全成熟所需要的时间明显短于体外[8]。

2、白色念珠菌生物膜的信号传导

生物膜不是浮游细胞的简单融合，而是在信号分子控制下的有组织的细胞群落[9]。白色念珠菌的酵母态和菌丝态间可逆的转换能力对于其生物性和致病性的多重表现是非常重要的，在白色念珠菌生物膜的形成过程中也起着重要的作用[10]。研究表明白色念珠菌可释放一种被称作法呢醇的物质，其分泌水平与白色念珠菌细胞增殖数量的增加呈反比，它阻止酵母相向菌丝相的转化，促使菌体从原生物膜上分离游走，继续附着、生长、分化，形成新生物膜。这样不仅控制了过量细胞造成的营养竞争，有利于生物膜共同体存在，也对感染灶的播散和建立有着重要的意义[4]。

负荷感应系统是生物膜形成的基础，通过负荷感应来反馈抑制菌群的复制，使定植群落大小合适，形成成熟的生物膜[10]。法呢醇是一种重要的负荷感应分子，Cao等[11]用部分白色念珠菌cDNA微点阵法研究在法呢醇负荷条件下白色念珠菌生物膜的基因表达，一些与菌丝形成相关的基因及耐药基因和编码一些蛋白的基因的表达与法呢醇负荷条件相关联。另外一种负荷感应分子是酪醇，在条件允许的情况下，它可加速菌丝的生长[12]。此外，Kruppa等[13]研究发现，负荷感应和生物膜的形成受双组分信号转导蛋白Chk1p的调控。

3、白色念珠菌生物膜的耐药机制

形成生物膜的白色念珠菌对大多数传统抗真菌药具有耐药性[14]。白色念珠菌生物膜形成后平均MIC50是游离态白色念珠菌的5~8倍，平均最小抑菌浓度(MIC)是游离菌的30~倍[7]。按照耐药抗性的产生是在接受抗生素之前还是之后可以分为原发性抗性和继发性抗性两类。

3.1原发性抗性

3.1.1生物膜基质阻碍药物的渗透大多数研究表明生物膜ECM可以抑制或延迟药物的渗透，这与药物的种类及其与生物膜的结合能力有关[4]。胞外多糖(EP)基质可抑制抗生素的渗入和结合带电荷的抗生素分子[15]。大分子在渗透入生物膜时要通过更加迂曲的途径，这可能是药物进入生物膜受阻的原因[16]，而ECM的厚度不同对药物的耐药性无显著差异[2]。定量研究结果表明，白色念珠菌游离细菌的EP与生物膜细菌EP中的葡萄糖含量不同，由此提示该菌可能通过调节编码碳水化合物合成有关酶类基因的表达，进而合成生物膜特异的EP[17，18]。

3.1.2基因水平的耐药机制白色念珠菌ABC传输体构成一个多基因抗性家族，其中外排泵编码基因CDR1、CDR2和MDR1的过度表达是游离态白色念珠菌对唑类药物耐药的重要机制之一，它们的过度表达可将进入白色念珠菌细胞内的药物泵出胞外[19]。现已发现编码流出泵的基因无论体外还是体内同生物膜形成的过程呈正相关[20]。Mukherjee等[21]发现缺少CDR和MDR1基因的变异株形成的生物膜厚，对氟康唑的敏感性比未变异株高。Rh外排实验证实了在白色念珠菌生物膜形成早期，其对Rh外排率较游离态白色念珠菌高，但在生物膜形成晚期二者无明显差异，这说明在生物膜形成的不同阶段，编码药物外排泵的基因表达不同。另外，还有研究发现，一种编码白色念珠菌菌丝态细胞壁特异性蛋白的基因HWP1在生物膜中表达下降[3]，从而导致了一些抗真菌药物作用靶点的缺失。生物膜形成时，可有更多的基因表达。由此提示，生物膜形成时发生接触诱导表达以及转录活性的改变，从而导致了生物膜形成过程白色念珠菌代谢增强，耐药抗性增加。

3.2继发性抗性氟康唑等唑类药物通过抑制细胞色素P的功能导致麦角甾醇生物合成受阻，从而达到抗真菌的作用。但麦角甾醇含量的下降和膜甾醇成分的变化导致其对抗真菌药物敏感性的下降而产生耐药性[7]。固醇的测定显示麦角固醇在生物膜发育过程有很大改变，其中成熟期和中间期较早期明显降低。Mukherjee等[21]最近研究了白色念珠菌生物膜在各生长阶段里甾醇成分和耐药性的变化。生物膜形成的间期与成熟期和早期相比麦角甾醇的含量分别下降41%和50%，表明麦角甾醇可能参与了白色念珠菌间期和成熟期的生物膜耐药。

4、防治策略

4.1传统抗真菌药物传统抗真菌药物分为外用和内用两类。内用药物多为广谱抗真菌药，包括以制霉菌素与两性霉素B为代表的第一代抗真菌药物，以唑类药物为代表的第二代抗真菌药和以5氟胞嘧啶为代表的第三代抗真菌药。各代抗真菌药常联合使用，但其对于白色念珠菌生物膜的治疗效果不佳，治疗不良反应大。

4.2、新型抗真菌药物卡泊芬净(caspofungin)是棘白菌素类抗真菌药物，其抗菌机制为抑制真菌细胞壁(1，3)-葡聚糖合成酶，它能改变生物膜内细胞的形态和代谢状态，对抗白色念珠菌生物膜的效果显著[22，23]。同类药物中的米卡芬净(micafungin)也有类似的抗白色念珠菌生物膜作用[24]。

白色念珠菌自身合成的前列腺素E2在其生物膜形成过程中有重要作用，这提示环氧化酶抑制剂-非甾体抗炎药可能具有抑制该菌生物膜形成的作用。Alem等[25]的研究证实了这一推论，并发现阿司匹林能在治疗浓度范围内对白色念珠菌生物膜产生明显抑制作用，在培养基中加入前列腺素E2后这种抑制作用则消失。非甾体抗炎药的引入为生物膜的治疗开辟了一条新的途径。

目前，两性霉素B脂质体对白色念珠菌生物膜的活性是肯定的，其机制还不清楚，可能与它的磷脂分散相使其更容易通过ECM有一定关系。此外，法呢醇能阻止白色念珠菌二相转换的特性使得早期用高浓度法呢醇可抑制生物膜的形成[16]。

4.3新型抗真菌材料生物膜的特性决定了生物膜一旦建立后消灭极为困难，因此阻止生物膜的形成是防治生物膜相关性感染的第一步。有研究成功运用表面覆有卡泊芬净的生物材料来抑制白色念珠菌生物膜的形成[22，23]，并有类似的方法运用到了导管相关的菌血症处理中[4]。

5展望

白色念珠菌生物膜形成是其表面生长的重要结构，是临床上医疗植入物发生血源性白色念珠菌感染传播的主要诱因，也是抗真菌耐药形成的重要因素，它的形成和耐药机制的复杂性决定了生物膜相关性感染的临床治疗极为困难。相对于其他研究，生物膜研究起步较晚，仍然存在很多问题有待解决，如它的负荷感应系统如何建立、更确切的耐药机制及细菌-真菌的复合生物膜的特性等。随着基因芯片和蛋白质组学新技术的问世，对其进一步的研究将会提供潜在的治疗途径，为彻底医院内感染带来新希望。

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